王镜岩生物化学考研复习笔记之DNA的复制

王镜岩生物化学是考取生化方向研究生同学们的基础教材，在前期复习中同学们应该已经将书通读一遍，由于书中内容较多，建议同学们冲刺阶段的复习，以精炼的笔记为主，下面就由查字典公务员考研带着大家复习一遍此书的重点内容。

第九章 DNA的生物合成(复制)

第一节 DNA的复制

自从1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构模型和DNA半保留复制假说后，关于遗传信息的传递，科学界出现了一场空前热烈的探索。遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，通过DNA复制由亲代传递给子代;在子代的生长发育过程中又自DNA转录给RNA，然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种功能，使后代现出与亲代相似的遗传性状。

一、DNA的半保留复制(semiconservation replication)

1.概念：DNA复制的一种方式。每条链都可作为合成互补链的模板，合成出的两分子双链DNA，每个分子都是由一条亲代链和一条新链组成。

2.实验证明：1958年，Meselson和Stahl通过一个著名的实验证明了Watson和Crick的推测。实验设计是以大肠杆菌为材料，培养基以15N标记的NH4Cl作为N的惟一来源(重氮培养基)。经过15代传代培养，使其DNA全部变成[15N]DNA。然后转移到轻氮培养基传代培养，每隔一定时间取样，对DNA进行分析(CsCl密度梯度离心)，其结果呈规律性的变化：

在0代细菌中，DNA双链中氮的分布为15N/15N，对DNA密度梯度离心，得浮力密度为1.724g/ml;在第1代细菌中，DNA双链中氮的分布由15N/15N转为15N/14N，其浮力密度为1.717g/ml;在第1代以后的细菌中，DNA双链中氮分布有两种，即15N/14N和14N/14N;随着传代次数的增加，双链均含14N的DNA的比重越来越高。

1963年Cairus用放射自显影的方法第一次观察到完整的正在复制的大肠杆菌染色体DNA。

3.意义：半保留复制是DNA复制最重要的特征。这种方式使子代保留了亲代DNA的全部遗传信息，说明DNA在代谢上的稳定性。物种稳定的分子基础就是遗传的相对保守性，体现在代与代之间DNA碱基序列的一致性，或者说某种生物的后代只能是它的同种生物而不是其他。

二、DNA复制的起点和方式

基因组能独立进行复制的单位称为复制子(replicon)。每个复制子都含有控制复制起始的起点(origin)，可能还有终止复制的终点(terminus)。

(一)环状DNA双链的复制

大肠杆菌DNA复制始于单一起点或原点(oriC)，双向、等速、对称进行。在电镜下复制的起点与复制的DNA部分犹如眼睛，称复制眼，包括两个反向运动的复制叉(replication fork)，形成型。复制叉移动速度约50000 bp/min。染色体完成复制需要40 min。

某些病毒及噬菌体DNA复制时，可以观察到单向滚环型复制。在哺乳类动物线粒体DNA复制中发现，两条链的合成是高度不对称，一条链上迅速合成出互补链，另一条则为游离的单链环(即D-环)。

(二)线性DNA双链的复制

真核生物染色体DNA是线性双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子。虽然其复制叉移动慢(1000~3000bp/min)，但同时起作用的复制叉数目大，DNA复制的总速度比原核生物还快。

三、与DNA复制有关的酶

DNA指导下的DNA合成，是一个复杂、有序的酶促反应过程，涉及几十种酶和因子参与。

1.DNA聚合酶(polymerase)

1956年Kornberg等首先从大肠杆菌中发现DNA-polI，能催化脱氧核苷酸加到引物链的3-OH末端，引物延伸方向53。该酶需要的条件：4种dNTP、Mg2+、DNA模板(template)、引物(primer)，此酶有三种活性：53聚合酶，53外切酶(切除引物和突变片段)，35外切酶(校正活性)。

70年代初又从大肠杆菌分离出DNA-polⅡ和polⅢ。polⅡ无5 3 外切酶活性。polⅢ是大肠杆菌主要的DNA聚合酶，其全酶由10种亚基组成，、、组成核心酶，亚基具有5 3方向合成DNA的催化活性，亚基具有3 5核酸外切酶的活性，起校对作用。DNA polⅢ为异二聚体，使DNA解开的双链可同时进行复制。这种复杂的亚基结构使其具有更高的忠实性、协同性和持续性。

2.拓扑异构酶(topoisomerase)和解链酶(helicase)

环状DNA的三级结构(超螺旋)存在拓扑异构体，拓扑一词原意是指物体做弹性移位而又保持不变的性质。DNA复制时必先要解旋和解链，拓扑异构酶对DNA分子兼有内切酶和连接酶的作用，有I型和Ⅱ型。前者可切断双链中的一条链，使解旋中不致打结(适时又把切口封闭，DNA呈松弛态，这过程不耗能)。后者在无ATP供能时，可同时切开超螺旋状态DNA的两条链，使其松弛，然后将切口封闭(用于分离复制后的两个子环)。在利用ATP时，该酶可使松弛态的DNA变成负超。

解链酶可通过水解ATP供能来解开双链，每解开一对碱基，需水解2分子ATP。该酶和rep蛋白共同参与解链，rep蛋白是沿着前导链的模板(母链)35方向移动，而解链酶按母链53方向移动。

3.引物酶(primase)和引发体

DNA聚合酶没有催化两个游离dNTP聚合的能力，而RNA聚合酶依靠模板可酶促游离NTP聚合，生成的一段短RNA引物提供3- OH末端供dNTP加入、延长。所以，解开双链并不是马上进行复制，先以模板脱氧核苷酸序列，按碱基互补原则合成一小段RNA引物，这一过程称引发。引物RNA与模板DNA形成杂交。催化RNA引物合成的RNA聚合酶称引物酶(或引发酶)。该酶只有与相关的蛋白结合为引发体才有明显的活性。引发体是解链酶、DnaC、引物酶和DNA起始复制区组成的复合结构。

4.DNA连接酶(DNA ligase)

催化相邻DNA片段间的连接，即把有缺口的3- OH末端与相邻核苷酸5-磷酸连接形成磷酸二酯键，连接反应是耗能的。大肠杆菌的DNA连接酶以NAD+为能量来源，动物细胞和某些噬菌体以ATP为能量来源。这两个DNA片段必需与同一个互补链结合。

5.单链结合蛋白(single-strand bindingprotein，SSB)

一旦DNA双螺旋解开成单链，SSB便牢固地结合到分开的单链上，防止它们重新形成双螺旋，保证模板链的复制和不被核酸内切酶水解。原核生物的SSB与DNA的结合表现出明显的协同效应，当第一个SSB结合后，其后的SSB与DNA的结合力可提高103倍，且结合迅速扩展，直到全部单链DNA都被SSB覆盖。而真核生物的SSB没有此协同效应，也不象DNA聚合酶那样沿复制方向向前移动，而是不断地结合、脱离，直到复制完成。

6.其他因子

和引发酶结合成引发体的相关蛋白有6种，priA、priB、priC、、dnaB、dnaC、dnaT。与复制过程有关的起始因子、终止蛋白因子等。

四、DNA半不连续复制

DNA分子的两条链是反向平行且互补的，而所有已知的DNA聚合酶的合成方向都是5 3。这很难说明DNA在复制时两条链同时作为模板合成新的互补链。为了解决这个矛盾，1968年, 日本学者冈崎通过实验研究 (3H标记的脱氧胸苷的密度梯度离心技术)，提出了半不连续复制理论。

DNA解链复制时，以3 5走向为模板的复制链可顺着解链方向延长，其复制过程是连续的，此链称为前导链(leading strand)。而沿着解链方向5 3模板链合成的互补链，出现了复制方向与解链方向相反，此时，必须等模板链解出足够长度，在引物3-OH末端，沿5 3方向先合成小的DNA片段(冈崎片段)，这些片段是不连续的，最后连成一条完整的链，称后随链(lagging strand)。前导链的连续性在许多因素作用下也会出现不连续性。如模板链的损伤、一条链上有多个复制起始点、复制因子和底物供应不足等，都会引起前导链复制的中断，并从一新的起始点开始复制。前导链和后随链是指同一复制叉上的两条链。

五、原核生物DNA的复制过程

(一)复制的起始

这是复制中较复杂的环节，参与因子较多，是把DNA解成单链和生成引物。

E.coli复制始于单个位点(oriC)，有245bp的序列，一般含两个反向重复单位和三个串联重复单位。

解链是一种高速的反向旋转，其下游势必发生打结现象。拓扑酶通过切断、旋转和再连接作用，实现DNA超螺旋的转型，正超螺旋变负超;DnaA蛋白辩认并结合oriC重复序列的位点，解链酶(DnaB蛋白，rep蛋白)解开双链(DnaC蛋白协助解链);SSB和引发酶进入，生成的引发体到达适当位置就可按模板催化NTP的聚合，生成引物，这标示复制起始的完成。后随链是不连续复制的，引发体需多次生成。

(二)复制的延长

DNA-polⅢ在引物的3-OH端，按模板碱基序，催化加入的dNTPs生成磷酸二酯键，子链的延长按53方向延伸，其速度相当快。E.coli基因组，即全套基因染色体上的DNA约3 000kb。按20分钟繁殖一代，每秒加入的核苷酸数达2500bp。随从链先是生成若干短的冈崎片段，片段之间的连接由RNA酶水解去掉引物，留下的空缺(gap)由DNA-polI催化填补，再由DNA连接酶将两个片段连在一起。

(三)复制的终止

一般说来，复制的终止不需要特定的信号，未发现有关的酶。E.coli环状DNA是双向复制，起始点和终点刚好把环分为两个半圆，两个方向各进行180度，复制至最后的3-OH末端，可延长填补起始复制时形成的引物所留下的缺口。

六、真核生物DNA的复制

真核生物基因组比原核生物大得多，其染色体以核小体为结构单位组成，因此DNA的复制过程相当复杂。其特点：

1.有多个复制原点，可分段复制。一个复制叉的移动速度虽比原核生物慢，且不连续，但利用多个复制原点可加速复制，所以总的复制速度还是快的。

2.真核生物DNA聚合酶有5种，以、、、、命名。pol主要催化合成引物，随从链多次合成的引物包含有DNA片段。pol有解螺旋酶的活性，催化链的延长。与修复DNA，复制线粒体DNA。

3.端粒复制

端粒(telomere)是真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。形态学上，像两顶帽子盖在染色体两端。端粒在维持染色体的稳定性和DNA复制的完整性上有重要作用。

线性DNA复制终止时，新链最早出现的5-端引物被降解后，留下的空缺没法填补，导致DNA末端有可能缩短。事实上染色体多次复制并没有变短，这是因为端粒有一特化的DNA序，富含T、G短序列的多次重复。端粒酶可催化端粒的复制。

端粒酶(telomerase)是1985年发现的一种核糖核蛋白酶，由三部分组成：端粒酶RNA、端粒酶协同蛋白和端粒酶逆转录酶。该酶兼有提供RNA模板和催化逆转录的功能，通过一种称为爬行模型的机制维持染色体的完整。端粒酶结合后，依其RNA模板，在端粒单链3-OH为引物基础上，不断反向转录，催化其延长，到一定长度，形成G-G配对的发夹结构，3-OH端回折与互补链方向一致，端粒酶脱落，由DNA聚合酶催化，按新延伸的链为模板合成互补链。DNA末端复制变短和用端粒酶增加其长度，这两个过程处于平衡状态，所以染色体保持大致相同的长度。

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